医院首页 | 在线导医 | 咨询专家 | 预约挂号 | 就医指南

创伤后鼠颞下颌关节中感觉神经肽阳性纤维

被浏览了 次, 发表日期: 2010-09-17 20:15:00

  目的:观察间接创伤后鼠颞下颌关节中感觉神经肽阳性纤维分布及密度的动态变化,探讨感觉神经肽在颞下颌关节疾病中的作用。方法:将42只SD大鼠随机均分为6组,分别在创伤前、创伤后1天、3天、7天、14天和28天处死,灌注固定后取双侧颞下颌关节,脱钙后恒冷切片,ABC法漂染,并对结果进行半定量分析。结果创伤前鼠颞下颌关节中有广泛而丰富的降钙素基因相关肽和P物质阳性纤维的分布。创伤后两种神经肽阳性纤维的密度均显著降低,分别在创伤后3天、1天达到最低值,然后逐渐增加,至28天时达到或超过正常值。结论创伤后颞下颌关节中感觉神经肽的逆行释放显著增加。它们不仅参与痛觉传导,而且是颞下颌关节病理改变的神经源因素。解放军81医院口腔科刘向辉

关键词  颞下颌关节  神经肽  创伤

Dynamic variation of distributions and densities of sensory peptidergic nerves in temporomandibular joints post-traumas in rats

[Abstract]  Objective: To observe dynamic variation of distributions and densities of Calcitonin gene related peptide (CGRP) and Substance P (SP) nerve fibers in the temporomandibular joints(TMJs) in rats post-traumas,and investigate  the role of neuropeptides in articular pathological changes. Methods: Forty-two rats were divided into six groups randomly and equally. One group was comparative and killed before traumas , Other groups were killed respectively on 1stday, 3rd day, 7th day, 14th day and 28th day post-traumas. Then, TMJs were taken out and stained using ABC method, and results were treated by semi-quantitative analysis. Results: In normal TMJ of rat, CGRP- and SP- nerves were plentiful and extensive. Densities of both nerve fibers decreased significantly early after trauma to TMJ, and reached minimums respectively on 3rdday and 1stday, then increased gradually, and reached or exceeded the normal value on 28th day. Conclusions: Traumatic irritation to TMJ induced the increase of neuropeptides’ releases in TMJs of rats; The

    近年的研究证实感觉神经系统不但顺行向中枢传导痛觉,而且通过逆行释放感觉神经肽P物质(substance P ,SP)和降钙素基因相关肽(calcitonin gene- related peptide,CGRP)参与了膝、踝等大关节炎疾病的发生与发展。它们不但是传导痛觉的神经递质,而且具有神经调质、炎症介质和生长因子等的活性,是关节疾病的神经源组成部分[1]。与膝踝等关节相比,颞下颌关节(temporomandibular joint, TMJ)中肽能神经分布更丰富,滑液中神经肽的浓度更高,提示神经肽对TMJ发病机制的作用可能更强[2]。为此本实验观察了间接创伤后鼠TMJ中肽能神经分布及密度的动态变化,探讨神经肽与TMJ病理改变间的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物:SD大白鼠56只,雄性,体重180-220克,鼠龄4周。

1.2 试剂:兔抗鼠CGRP血清(-抗)和合成鼠CGRP纯品(Watpa,新西兰),兔抗鼠SP血清(-抗)和合成鼠SP纯品(Serotec,美国),ABC试剂盒、DAB及葡萄糖氧化酶(Sigma,美国)。

1.3 仪器:自制打击装置:打击架高50cm,铁块重1kg,柱状软木塞直径3cm、高4cm。计算机图

像分析系统:Quantinet570图像分析仪(Leica,德国)。  

1.4 模型建立:将56只大鼠随机均分为7组,每组8只,所有动物在同一饲养条件下喂养3天后,乙醚麻醉,除第一组外,将其余六组大鼠分别仰位固定于打击架的底座上,使鼠下颌角与关节连线垂直于底座,正对上方,将木塞紧贴于鼠下颌角,使铁块自45cm高处自然落下,准确撞击木塞,冲击下颌角,如此依次操作左右两侧。术后大鼠进食减少,2天后关节轻度肿胀,4天后正常进食,随后体重继续增加。

1.5 标本制备:第一组鼠于麻醉清醒后即处死,其余六组分别于术后1天、3天、7天、14天、21

天、28天处死。方法是麻醉后灌注固定, 取双侧TMJ置于15%EDTA液中脱钙4周,20%蔗糖液中脱

水24小时。

1.6 切片与染色: 将各鼠两侧TMJ用恒冷切片机分别行矢状和冠状连续切片,片厚45μm,将每

组切片随机均分为3个亚组:CGRP组、SP组、对照组。各组切片经洗涤、封闭内源性过氧化物酶

及生物素后,ABC法漂染,DAB+硫酸镍胺+葡萄糖+葡萄糖氧化酶呈色15分钟后终止反应。

1.7 对照实验: ①空白对照:用0.01MPBS取代一抗;②血清对照:用正常兔血清取代一抗;③吸收对照:分别用合成鼠CGRP、SP纯品加入相应稀释之一抗中,置4度湿盒中48小时后离心,用上清液取代一抗。

1.8 光镜下观察、摄像、计算机图像分析TMJ中阳性纤维的表面积。

2 结果

正常鼠TMJ的关节囊、关节盘、盘周附着、滑膜、骨膜和肌筋膜中均有广泛而丰富的CGRP和SP阳性纤维分布,纤维粗细不等,直径0.3μm~0.7μm,主要是细纤维和中等粗细纤维;两种阳性纤维的形态和分布相似,但是SP阳性纤维多为细纤维,密度较低(图1),CGRP阳性纤维多为中等粗细纤维,密度较高(图2)。纤维走行迂曲,方向不规则,多数由许多棕褐色膨体呈串珠状构成,少数细纤维呈近似均质的腊肠状。关节盘前、后附着区组织中的阳性纤维密度最高,它们和关节囊中的阳性纤维都是主要沿血管周围呈网状、环状或放射状分布,末梢终止于血管内膜外层,动脉周围多于静脉周围;其余阳性纤维呈网状、丛状或游离末梢分布于结缔组织中。关节盘前后带以及中间带的内外侧边缘区均有阳性纤维分布,多呈树枝状、网状或散在分布于关节盘上、下1/3边缘区,末梢多终止于关节盘上下表面,但关节盘中心区没有阳性纤维。滑膜层也有丰富的阳性纤维,呈丛状迂曲走行于内膜下层,部分穿过内膜层,末梢显著曲张,终止于滑膜表面。滑膜皱襞和指状突起中的阳性纤维密度更高,曲张状态更明显。

术后第1天,关节各区中CGRP、SP阳性纤维的密度均显著降低。CGRP纤维散在分布,有少量网状、丛状或束状纤维结构,染色较淡。SP阳性纤维稀少,血管周围也较少见,组织内无网状、丛状等阳性纤维结构。

 术后第3天,关节各区CGRP阳性纤维进一步减少,只见稀疏分布的散在纤维(图3).SP阳性纤维密度与前一组相比无明显变化。

 术后第7天,关节各区CGRP阳性纤维数量增加,染色加深。SP阳性纤维略有增加,血管周围有散在阳性纤维分布。

 术后第14天,关节组织内散在CGRP阳性纤维数量增加,血管周围出现束状或网状阳性纤维,束内多条纤维之间以及纤维束走行区背景显著加深,可能滞溜于局部的释放物增加。SP阳性纤维进一步增多,染色加深,但仍很少见到阳性纤维束、纤维网。

 术后第21天,关节各区CGRP阳性纤维增多,染色深,多呈网状或丛状分布,尤其在血管周围明显,出现粗大的阳性纤维束,束内纤维数量多,密度高。SP阳性纤维明显增多,出现丛状及网状阳性纤维。

 术后第28天,关节中CGRP阳性纤维密度进一步增加,染色深,似匀质状的纤维增多,血管周围多见粗大纤维束,内有许多条纤维密集走行,并有纤维出芽现象(图4)。SP阳性纤维数量增加,染色加深,似均质状纤维增多,纤维密度接近正常关节中。

为检测鼠TMJ中CGRP、SP阳性纤维密度变化的情况,从每只鼠的TMJ中部切片中随机抽取矢状及冠状切片各一张,将鼠TMJ分为关节盘前带、关节盘后带、盘前附着、盘后附着及关节囊等5个区,用计算机图像分析系统检测定义框(面积6847.65 mm2)内各鼠TMJ 5个区的SP和CGRP阳性纤维的密度值,相加后取均值,再将同组鼠的密度值相加,取均值作为本组鼠TMJ的CGRP、SP阳性纤维密度值。结果见附表:  

表1 鼠TMJ创伤后CGRP、SP阳性纤维密度的变化(mm2)

Tab1 Dynamic variation of densities of Calcitonin gene related peptide (CGRP) and Substance P (SP) nerve fibers in the temporomandibular joints(TMJs) in rats post-traumas(mm2)

    时间              

肽类      正常        1天          3天       7天        14天         21天         28天

CGRP  287.8±46.7  91.2±20.5**  89.7±30.4  93.3±23.5   126.2±24.5*  218.7±36.6 **  292.5±54.3**

SP      98.5±26.7  23.7±19.5**  36.8±13.6  54.9±17.5*   60.7±14.4   84.6±12.6**     89.3±20.7

 


注:与前一组相比P<0.05为* , P<0.01为**。   

   统计学分析表明: CGRP组阳性纤维的密度在术后1天明显下降,在术后3天、7天变化不显著,其中在术后3天最低,而在术后7天、14天、21天、28天,密度均显著逐渐升高,到28天时略超过正常TMJ中的水平。SP组阳性纤维的密度在术后1天显著下降,达到最低,随后逐渐升高,在术后7天、21天纤维密度升高显著,在术后3天、14天和28天升高不显著,在术后28天接近正常TMJ中的水平。

3 讨论

一些临床现象提示,感觉神经系统通过向外周逆行释放的感觉神经肽参与了滑膜关节炎性疾病的发生与发展,如关节滑膜炎常是双侧对称性分布;患骨关节炎和类风湿性关节炎偏瘫患者,麻痹侧关节无炎症表现;关节疾病的发作和加重常继发于某些神经心理因素如心理创伤、焦虑和压抑之后[1,2]。动物实验表明将SP注入鼠膝关节腔内可引起急性关节炎,而预先应用SP拮抗剂、辣椒素或切断关节的感觉神经可有效降低鼠实验性关节炎的发生;神经生物学的研究证实SP和CGRP阳性纤维均是三叉感觉神经纤维的一部分,属无髓鞘C-纤维,并且两者可以共存于同一条神经纤维中[3,4]。有关TMJ中CGRP和SP阳性神经纤维的分布已得到证实,但对创伤后TMJ中CGRP、SP阳性纤维密度的变化及其与病理改变间的关系,国内外尚未见报道。本实验表明正常鼠TMJ中有广泛而丰富的CGRP和SP阳性纤维的分布;在鼠TMJ受到间接创伤后,关节中CGRP、SP阳性纤维的密度呈动态变化,尤其在血管周围更为明显;创伤后早期,TMJ中两种肽能纤维均显著减少,SP阳性纤维密度值在术后1天最低,CGRP在术后3天最低;随后两种阳性纤维的密度逐渐增加,至28天达到正常值附近,尤其在血管周围显著增多,有粗大的阳性纤维束出现。神经生物学研究表明肽能神经在病理刺激下,不仅顺行向中枢传导痛觉,而且逆行释放的神经肽显著增加,神经肽迅速排空,导致阳性纤维密度降低;临床实验也表明膝关节炎和TMJ炎患者滑液中CGRP、SP的浓度均显著升高[1,4,6]。因此,本研究认为创伤后早期TMJ中肽能神经的减少是由于创伤刺激引起神经纤维中感觉神经肽迅速排空,即局部释放量增加所致,然后随着合成的增加和释放的逐渐减少,创伤后期神经肽的密度逐渐升高。       

创伤后神经肽的释放显著增加,它们通过如下的机制参与了TMJ疾病的发生与发展:①对血管的作用:SP和CGRP均能显著扩张局部动、静脉,尤其是动脉,增加局部血流量,引起充血;同时促进血管内皮细胞释放内源性血管舒张因子和肥大细胞释放组胺,增加血管壁的通透性,导致局部水肿和炎细胞浸润。②对滑膜的作用:SP不仅促进滑膜细胞增生,而且提高滑膜细胞中A细胞的吞噬能力;本实验表明在关节组织破坏的同时,滑膜细胞显著增生,而关节腔内组织损伤后脱落的大量坏死组织及渗出物也得到有效的清除。③调节局部免疫和炎症介质的释放:感觉神经肽能促进单核-巨噬细胞、中性粒细胞及嗜酸性粒细胞等的渗出、趋化、游走及吞噬等功能,促进单核-巨噬细胞系释放IL-1、IL-6、TNF-α等及滑膜细胞释放PGE 、胶原酶等金属蛋白酶,还可引起成纤维细胞分泌PGE、胶原酶。④对结缔组织的作用:SP和CGRP均可促进成纤维细胞增生和合成胶原纤维,并控制细胞增生的速度和方向;创伤后关节盘、盘周附着、关节囊等组织的修复可能与此有关。⑤痛觉传导功能:SP和CGRP均是初级感觉神经元的兴奋性递质,能够传导关节疼痛等感觉信息及引起痛觉过敏;有研究证实关节炎时由于关节局部SP、CGRP的分泌增加,引起痛觉过敏,对正常的刺激也变得敏感,这可能是关节炎持续疼痛的原因之一[4,5,6,7]。

结合同一研究中对创伤后TMJ的病理学观察,本实验认为创伤后早期CGRP、SP的释放迅速增加,它们通过引起局部组织的充血水肿和炎细胞浸润参与了TMJ的急性炎症反应。而同时CGRP、SP也促进了IL-1、PGE  、胶原酶和TNF-α的分泌,这些是目前已知的引起关节炎症和组织破坏的关键因子,它们在创伤造成的表面组织损伤的基础上直接作用于深部组织,引起继发性破坏,而神经肽本身并不破坏组织.创伤后期感觉神经肽还通过促进滑膜细胞和成纤维细胞的增生等参与了关节组织的修复及过度增生反应,但目前神经肽对软骨细胞的增生及合成软骨基质的作用尚不清楚[8]。

本实验认为感觉神经肽在创伤后TMJ的致病机制中具有重要作用,它们不但参与痛觉传导,而且可能是创伤刺激和TMJ病理改变之间的介导因素。实验有助于进一步研究神经因素在TMJ疾病中的作用机制及寻找更为有效的治疗TMJ疾病的方法。

 

 

参考文献

⑴    Cruwys SC; Garrett NE; Kidd BL. Sensory denervation with capsaicin attenuates inflammation and nociception in arthritic rats[J]. Neurosci Lett,1995; 193(3): 205-207.

⑵    Tahmasebl S A, Tedman R, Goss A N. Distribution and coexistence of neuropeptides in nerve fibres in the temporomandibular joint of late gestation fetal sheep[J]. J of Anatomy. 1997;191:245-257.

⑶    刘向辉、斯方杰、周树夏等。鼠颞下颌关节中降钙素基因相关肽阳性纤维的分

布及密度[J]。中华口腔医学杂志。2000, 35(1):39-41。

⑷    Bob H, Robert S, Robert J. Calcitonin gene-related peptide and Substance P immuno-reactivity in rat trigeminal ganglion and brainstem following adjuvant induced inflammation of the temporomandibular joint[J]. Archives of Oral Biology. 2000;45:335-345.

⑸    Ueki N, Tanaka E, Wakida O, etal.  Postnatal development of protein gene product 9.5 and calcitonin gene-related peptide immunoreactive nerve fibres in rat temporomandibular joint disc[J]. J of  Oral Rehabilitation. 2003; 30:152-159.

⑹    Henry C, Wolford l. Substance P and mast cells: Preliminary histologic analysis of the human temporomandibular joint[J]. Oral Surg Oral Med Oral Pthol. 2001;384-389.

⑺    Takeda M, Tanimoto T, Ikeda M, etal. Activation of NK1 receptor of  trigeminal  root ganglion via substance P paracrine mechanism contributes to the mechanical allodynia in the temporomandibular joint in rats[J]. Pain. 2005c;116:375-385.

⑻    刘向辉、张玲、斯方杰等。鼠创伤性颞下颌关节炎模型的建立[J]。口腔颌面外科杂志。2003;12(1):24-25,57.